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双色球和值走势图表中彩网大赢家:DH10B Electro

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双色球蓝球走势图表 www.axdbte.com.cn DH10B Electroporation-Competent Cell產品說明書





產品規格(CAT#: DE1070)

DH10B Electroporation-Competent Cell                50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期):                                         -80℃(6個月)



基因型

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galE15 galK λ-rpsL nupG

 

產品說明

DH10B電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。DH10B菌株來源于MC1061菌株,mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10B菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA (無論真核生物還是原核生物的基因組DNA都能被高效的轉入DH10B中)。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。φ80dlacZ?M15標記的存在使DH10B可用于藍白斑篩選,rpsL賦予其鏈霉素抗性。 DH10B感受態細胞適用于大質粒的構建或者各種文庫構建,經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率>1010 cfu/μg DNA。


操作方法

1. 0.1cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. -80℃保存的DH10B電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蛄硬?span lang="EN-US">)并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

B. 對于連接產物,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10mM Tris HCl, pH7.5; 1mM EDTA)重懸,DNA濃度不超過100ng/μl,體積不超過5μl/50μl 感受態。

3. 200 μl槍頭將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50ml離心管(BD Falcon50ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養基至5ml。37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。


S.O.C 培養基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

 

注意事項

1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;螄牖竦媒細咦?,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時不可用孔徑過小的槍頭 (普通200ul槍頭應剪去槍頭尖0.6cm) 避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蛄硬錕上嚶跎僮鈧沼糜諭堪宓木?。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。





說明書下載

DH10B Electroporation-Competent Cell產品說明書


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