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双色球基本走势图体坛:ArcticExpress (DE3)

文字:[大][中][小] 2018-7-5    瀏覽次數:798    

双色球蓝球走势图表 www.axdbte.com.cn ArcticExpress (DE3) Chemically Competent Cell 產品說明書




產品規格 (CAT#: EC2020)

ArcticExpress (DE3):                                       100μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                           10μl

保存條件(保質期):                                   -80℃(6個月) 


基因型


E. coli B F– ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ TetR gal λ(DE3) endA Hte [cpn10cpn60 GentR]



產品說明

ArcticExpress (DE3)來源于E. coli B,為Lon和OmpT蛋白酶缺陷型菌株,可促進表達蛋白的穩定。ArcticExpress (DE3)菌株染色體DNA中整合了λ噬菌體DE3區,使得ArcticExpress (DE3)菌株可同時表達T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶,廣泛用于pET系列,pGEX,pMAL等質粒的蛋白表達。ArcticExpress (DE3)菌株具有四環素,慶大霉素抗性,endA1突變有利于質粒DNA的穩定。[cpn10cpn60 GentR]的存在使ArcticExpress (DE3)可以表達適應低溫的伴侶蛋白Cpn10和Cpn60(來自嗜冷菌—Oleispira antarctica)。Cpn10和Cpn60伴侶蛋白在4-12℃表現出較高活性,在ArcticExpress (DE3)細胞中表達時,可降低重組蛋白包涵體的形成,增加可溶重組蛋白的表達量及生物活性,比傳統的原核表達伴侶蛋白GroEL、GroES等具有更加優異的促融性能。唯地生物生產的ArcticExpress (DE3)感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率達108cfu/μg DNA。



操作方法

1. ArcticExpress (DE3)感受態細胞從-80℃拿出,迅速插入冰中,5分鐘后待菌塊融化,加入目的質粒,并用手撥打EP管底混勻,冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒,迅速放回冰上并靜置2分鐘,晃動會降低轉化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養基 (LB),混勻后37℃,200 rpm復蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應抗生素的LB培養基上((平板中務必同時含有40ug/ml的慶大霉素和轉化質粒本身的篩選抗生素;若質粒濃度較高,也可稀釋后涂板,務必保證能在平板上挑到單克隆菌落)。

5. 將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。



Sample Induction Protocol (for reference only )

1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 3ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.

2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃ overnight. 

3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).

4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃ until the OD 600 reaches 0.5-0.8. (0.6 recommended; about 2.5h).

5. (Optional)Pipet 1ml of  the cultures into clean microcentrifuge tubes and  place the tubes on ice until  needed  for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-induced control samples.     

6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.

7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃ for 2-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.

8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 minutes at 4℃.

9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃ (storage at lower temperatures is also accep- table).  



IPTG配制:

     Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 

     by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use. 


注意事項

1. 感受態細胞最好在冰中緩慢融化,插入冰中8分鐘內加入目標DNA,不可在冰中放置時間過長,長時間存放會降低轉化效率。

2. 轉化高濃度的質??上嚶跎僮鈧沼糜諭堪宓木?。除復蘇培養基為無抗生素外,其余所用培養基、培養液均應含有40ug/ml的慶大霉素,以防質粒丟失。

3. 為獲得需要量的蛋白,最佳誘導時間,溫度,IPTG濃度需實驗者優化。

4. ArcticExpress (DE3)感受態細胞具有四環素、慶大霉素抗性,不可用于具有四環素、慶大霉素抗性質粒的轉化。




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ArcticExpress (DE3) Chemically Competent Cell 產品說明書
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