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克隆感受態_電轉

双色球ac值走势图:Stbl3 Electro

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双色球蓝球走势图表 www.axdbte.com.cn Stbl3 Electroporation-Competent Cell 產品說明書



產品規格(CAT#: DE1046)

Stbl3 Electroporation-Competent Cell                   50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期):                                         -80℃(6個月)



基因型

F- mcrB mrr hsdS20(rB-, mB-) recA13 supE44 ara-14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20 (StrR) xyl-5 λ-leu mtl-1 endA1+



產品說明

Stbl3菌株來源于 HB101 E. coli strain,是慢病毒載體系統推薦使用的菌株?;蜃楹兄刈槊?/span>recA13突變,可有效抑制長片段末端重復區的重組,降低錯誤重組的概率;但不含核酸酶endA1突變,體內核酸酶含量較高,提取質粒時務必使用質粒提取試劑盒中去蛋白液盡量去除核酸酶對質粒的污染。此菌株具有鏈霉素抗性,不存在lacIqZΔM15,不可用于藍、白斑篩選。唯地生物生產的Stbl3電擊感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率可達1×109 cfu/μg DNA。



操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的Stbl3電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蛄硬?并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

      A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

      B. 對于連接產物,大部分公司的T4連接酶反應體系或50度反應重組體系可與Stbl3電擊感受態混合后電擊轉化,無需             進行DNA純化,但DNA濃度不能過高,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

      C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM                   EDTA)重懸,然后與Stbl3電擊感受態混合進行電擊轉化。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養基至10 ml。37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。



S.O.C 培養基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0


S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 


注意事項


1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;螄牖竦媒細咦?,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,部分公司的連接體系或重組體系(例如:Thermo,NEB公司的T4 連接酶系統,NEB,天根的50度反應重組系統)可以直接Stbl3電擊感受態混合后電擊轉化,無需純化,但DNA濃度不能過高,最好不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蛄硬錕上嚶跎僮鈧沼糜諭堪宓木?。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。





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Stbl3 Electroporation-Competent Cell 產品說明書

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