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克隆感受態_電轉

双色球胆托组号:ClearColi K12 Electro

文字:[大][中][小] 2018-1-25    瀏覽次數:1748    

双色球蓝球走势图表 www.axdbte.com.cn ClearColi K12 Electroporation-Competent Cell產品說明書




產品規格(CAT#: DE2040)

ClearColi K12 Electro  Cell                                       50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                               10μl

恢復培養基                                                               50ml/瓶

保存條件(保質期):                                        -80℃(6個月)


基因型

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產品說明

ClearColi K12電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。ClearColi K12菌株來源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突變,導致ClearColi K12細胞壁外層的脂多糖(LPS)被修飾:LPS的低聚糖鏈被刪除,同時LPS的兩個?;匆脖簧境?,進而破壞了ClearColi K12大腸桿菌的內毒素信號通路,使得從該細胞中提取的蛋白或質粒DNA中的內毒素含量極低,提取的無內毒素質粒廣泛應用于后續的哺乳動物細胞轉化。ClearColi K12同時缺失核酸內切酶 (endA)和重組酶 (recA),提高了質粒DNA的產量和質量。唯地生物開發的ClearColi K12電擊感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率可達1×107 cfu/μg DNA。


操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的ClearColi K12電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA ,并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

    A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

    B. 對于未知來源或組分不明的質粒DNA,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM              EDTA)重懸,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入1ml不含抗生素的無菌恢復培養基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補加恢復培養基(室溫)至10 ml。37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的LB(務必使用高鹽培養基平板,不可用2YT,SOB,SOC等低鹽培養基)平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱中培養36-48小時(培養24小時后可看到很小的克?。?。


 

LB培養基1L(PH:7.0):                 

Yeast Extract     5g                       

NaCl           10g

Tryptone        10g

 

注意事項

1. 因ClearColi K12細胞壁外層的脂多糖(LPS)被修飾,細胞易死亡,不易保存,平板菌在4度存放時間應不超過1周。且適合在高鹽培養基中生長。

2. ClearColi K12電擊感受態效率很低,不適用于構建質粒使用,一般用來擴繁質粒,提取高質量的無內毒素的質粒;若構建質粒,請選用DH5a、TOP10等轉化效率較高的感受態細胞。

3. ClearColi K12菌株生長緩慢,平板在37度培養時間在36-48小時之間。

4. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

5. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

6. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

7. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

8. 若轉化大質?;螄牖竦媒細咦?,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

9. 對于連接產物轉化,最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

10. ClearColi K12菌株的細胞壁被修飾過,細胞比較脆弱,混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蛄硬錕上嚶跎儆糜諭堪宓木?。

11. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。





說明書下載

ClearColi K12 Electroporation-Competent Cell產品說明書

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