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克隆感受態_電轉

双色球基本走势图下载:SURE Electro

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双色球蓝球走势图表 www.axdbte.com.cn SURE Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格(CAT#: DE1065)

SURE Electroporation-Competent Cell                   50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                10μl

保存條件(保質期):                                         -80℃(6個月)



基因型

E. coli B e14-(mcrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F′ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (TetR)]



產品說明

SURE電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。真核生物DNA存在較多“十字型”、“Z字型”等二級或三級結構,這種DNA結構在利用傳統大腸桿菌進行克隆時易被大腸桿菌體內的重組酶系統或其他防御系統識別并對其進行重組,刪除等破壞,導致很難對這類DNA進行正確的克隆操作。SURE菌株可以解決這些問題:此菌株體內重組酶系統整條通路被破壞,并且 (mcrA-, mcrCB-, mcrF-, mrr-, hsdR-)這些限制性突變的存在賦予此菌株無法對外源DNA進行標記、限制,提高了外源甲基化DNA的克隆效率,同時具有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recB recJ)突變,增強了外源DNA的穩定性。存在于F′因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以進行藍白斑篩??;KanR,TetR賦予菌株卡那霉素和四環素抗性。SURE電擊感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19質粒檢測轉化效率>0.5×1010 cfu/μg DNA。

 

操作方法


1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙

醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中

靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的SURE電擊感受態細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蛄硬?

并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒 pUC19;

B. 對于連接產物,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重

懸,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用

電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入1ml不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml

槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中

補加S.O.C. 培養基至10 ml。傾斜45度放入搖床,37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,

若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養13-17小時。



S.O.C 培養基配方

 

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0 

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983). 

 

注意事項


1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;螄牖竦媒細咦?,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蛄硬錕上嚶跎僮鈧沼糜諭堪宓木?。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。




說明書下載

SURE Electroporation-Competent Cell 產品說明書




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