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克隆感受態_電轉

双色球基本走势图新浪爱彩:BJ5183-AD-1 Electro

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双色球蓝球走势图表 www.axdbte.com.cn BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell 產品說明書




產品規格(CAT#: DE1076)

BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell             50μl/支

pCAMBIA2301 (control vector, 10ng/μl):                            10μl

保存條件(保質期):                                                -80℃(6個月)


基因型

endA1 sbcBC recBC galK met thi-1 bioT hsdR (StrR) [pAdEasy-1 (AmpR)] 



產品說明

BJ5183-AD-1是攜帶了腺病毒質粒pAdeasy-1的BJ5183菌株。BJ5183菌株是一種具有較高重組活力的大腸桿菌菌株,是目前腺病毒系統最常用的感受態細胞。BJ5183菌株含有sbcBC recBC雙重突變,賦予BJ5183細胞較強的重組能力,有利于轉入的目的基因與腺病毒骨架質粒的重組。endA1(缺失核酸內切酶)的突變有利于重組DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。BJ5183-AD-1菌株細胞中已經提前轉入了腺病毒質粒pAdeasy-1[encodes the Adenovirus-5 genome (E1/E3 deleted)],賦予該菌株氨芐抗性,在病毒質粒構建時,只需轉入線性化的目的質粒即可,簡化了實驗步驟,提高了病毒質粒重組概率。StrR 賦予BJ5183-AD-1菌株鏈霉素抗性。BJ5183-AD-1電擊感受態細胞適用于普通質粒和大質粒的構建,經特殊工藝制作,pCAMBIA2301質粒(size:1163bp)檢測轉化效率>1×106 cfu/μg DNA。

 


操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙

醇充分揮發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中

靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的BJ5183-AD-1電擊感受態細胞插入冰中5分鐘,待其融化,加入目的DNA (質?;蛄硬?并用手撥打EP管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。

A. 測定轉化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質粒pCAMBIA2301;

B. 對于連接產物,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重

懸,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用

電轉儀推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養基(室溫),用1ml

槍吹吸電擊杯底部數次混勻后,轉移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中

補加S.O.C. 培養基至10 ml。37℃,225 rpm復蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,

若全部涂板請選用直徑15cm培養皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養箱過夜培養。


S.O.C 培養基配方

 

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

 

注意事項


1. 加入DNA時體積不應大于感受態體積的1/10。

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。

3. 當DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和DNA的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質?;螄牖竦媒細咦?,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個數量級。

6. 對于連接產物轉化,最好轉化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產物,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。

7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃度的質?;蛄硬錕上嚶跎僮鈧沼糜諭堪宓木?。

8. 電擊感受態細胞最好保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。




說明書下載

BJ5183-AD-1 Electroporation-Competent Cell 產品說明書


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