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大腸桿菌轉化

双色球连号走势图网易:在使用Stbl3感受態時怎樣提高病毒質粒的產量?

文字:[大][中][小] 2016-6-6    瀏覽次數:2337    

双色球蓝球走势图表 www.axdbte.com.cn 在使用Stbl3感受態時怎樣提高病毒質粒的產量?

答:Stbl3菌株基因組中核酸內切酶A1基因(endA1+)為野生型,沒有被突變。在質粒提取過程中,微量的endA1與質粒一起被提取,導致質粒降解。為了提高Stbl3菌株中的病毒質粒產量,可采用以下方法:

A,使用商業化的高純度質粒提取試劑盒(推薦:QIAGEN #12362 EndoFree Plasmid Maxi Kit)。如使用其他公司產品,務必使用去蛋白液去除細胞內核酸酶對質粒的污染。

B,使用質粒提取溶液Ⅰ,,Ⅲ提取質粒時,確保溶液Ⅰ中含有10mM的EDTA(EDTA可使endA1失活),并且用酚/氯仿/異戊醇溶液多抽提幾次,盡量去除殘留的endA1。

C,接菌時用新鮮的菌斑,不要使用4℃保存的菌落接菌,搖菌時用大體積容器,300 rpm,增加溶氧量。

例如:小提質粒時,50 ml離心管中接入6 ml LB菌液,羧芐青霉素50 μg/ml,接新鮮克隆,37℃,300rpm  搖菌20小時;大提質粒時,2L離心瓶中接入200ml LB菌液,羧芐青霉素50 μg/ml,接新鮮克隆,37℃,300 rpm搖菌20小時。

D,對不穩定的克隆或病毒質粒優先以質粒狀態保存,盡量避免將質粒保存在大腸桿菌細胞中。對搖好的菌液應立即提取質粒,不可將菌液在室溫或低溫放置一段時間后提取質粒。

E,用Stable菌株代替Stbl3擴繁病毒質粒,Stable菌株與Stbl3相比,基因組含有endA突變,提取的質粒中無核酸內切酶污染,提高了病毒質粒的產量和純度,同時具有Stbl3菌株的優點,可降低病毒質粒錯誤重組的概率(唯地生物:Stable感受態細胞  /info.asp?third_id=88)。

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